小TIPS | PBMC提取步骤及注意事项
tips
PBMC提取步骤
1.
将抗凝血与等体积的PBS或生理盐水（无Ca²⁺/Mg²⁺）按1:1比例混合，降低血液黏度。
2.
在离心管（如15 mL或50 mL）中加入适量Ficoll分离液（通常与稀释后血液体积比为1:2）。
3.
将稀释后的血液用无菌塑料滴管沿管壁缓慢叠加到Ficoll液面上，避免混合。
4.
室温下离心（600-800 g，20-30分钟），开启离心机减速制动（brake off），避免扰动分层。
5.
离心后管内自上而下分为4层：血浆/PBS层、PBMC白膜层（云雾状）、Ficoll层、红细胞/粒细胞层。用无菌塑料滴管小心吸取白膜层（PBMC层），转移至新离心管。
6.
加入3-5倍体积的PBS或培养基（如RPMI-1640），轻柔混匀后离心（300 g，10分钟）。
7.
弃上清，重复洗涤一次，彻底去除残留Ficoll分离液和血小板。
8.
用台盼蓝染色法检测细胞活性（活细胞率应>95 %）。
9.
根据实验需求，用培养基（如含10 % FBS的RPMI-1640）或冻存液（如含10 % DMSO的FBS）重悬细胞。
注意事项
样本处理：
1）尽量使用新鲜样本（4-6小时内处理），长时间放置会导致细胞活性下降。
2）选择合适的抗凝剂
EDTA：适合大多数实验，但可能抑制某些酶活性。
肝素：避免用于后续依赖钙离子的实验（如某些细胞培养）。
柠檬酸钠：适合凝血相关研究。
01
操作细节：
1）全程室温操作，低温可能激活血小板导致聚集。
2）血液需缓慢叠加到Ficoll液面上，避免冲散分层液。
3）严格按照离心机型号调整参数，确保使用参数为离心力（g）而非转速（rpm）。避免离心机紧急制动，防止梯度破坏。
02
避免污染：
1）若PBMC中混入红细胞，可加入红细胞裂解液（如ACK缓冲液）处理。
2）通过多次低速离心（100 g，5分钟）去除血小板，可减少血小板污染。
03
细胞活性保障：
1）轻柔操作，避免剧烈吹打或高速离心（洗涤时不超过300 g）。
2）若需后续培养，使用含血清的培养基维持细胞活性。
04
生物安全：
1）穿戴手套、护目镜及实验服，处理人血需符合生物安全二级（BSL-2）规范。
2）血液样本和接触过的耗材需高压灭菌或按生物危害废物处理。
05
PBMC
Extraction steps&precautions
常见问题与解决
Q
细胞得率低？
A
检查血液与Ficoll分离液比例、离心条件是否合适。
Q
细胞活性差？
A
确保操作快速、避免高温或冻存不当。
Q
分层不清晰？
A
可能因血液未充分稀释或离心力不足，需优化条件。